GREENY WITH ME: KULTUR JARINGAN

KULTUR JARINGAN

09.51

Unknown

UNIVERSITAS JEMBER

FAKULTAS PERTANIAN

JURUSAN BUDIDAYA PERTANIAN

LABORATORIUM PRODUKSI TANAMAN

LAPORAN PRAKTIKUM

NAMA : BAYU GUSTI SAPUTRA

NIM : 111510501152

GOLONGAN/KELOMPOK : SENIN/3

ANGGOTA : 1. SITI NURHIDAYATI (111510501023)

2. BUDI REZQY N (111510501128)

3. FAISHAL IRFANDI (111510501147)

4. DWI HARTATIK (111510501150) 5. ANGGI RAHAYU W (111510501153)

6. YULI ARISTA (111510501154)

JUDUL ACARA : KULTUR JARINGAN

TANGGAL PRAKTIKUM : 2 APRIL 2012

TANGGAL PENYERAHAN : 16 APRIL 2012

ASISTEN : 1. DEDY EKO S

2. FRENGKY HERMAWAN

3. MEIDA WULANDARI

4. NOVITA FRIDA SAFATA

5. HAIKAL WAHONO

6. IFTITAH FIKA F

7. AHMAD NUR H G A

8. AKHMAD TAUFIQUL H

9. DIYAH AYU S

10. FIKA AYU S

11. HERLINA PUTRI

12. RAAF LUQMAN SYAH

13. KIKI ULFANIAH

BAB 1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta menumbuhkannya dalam keadaan aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman utuh kembali. Konsep awal dari kultur jarngan adalah diketahuinya kemempuan totipotensi dari sel tumbuhan. Totipotensi sel (Total Genetic Potential), artinya setiap sel memiliki potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi tanaman lengkap.

Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu adanya usaha sterilisasi peralatan yang akan digunakan dalam proses kultur. Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril. Sterilisasi pada teknik kultur jarngan meliputi: Sterilisasi lingkungan kerja, sterilisasi alat dan media dan sterilisasi bahan tanam. Tidak hanya terbatas pada peralatan, namun ruangan yang akan digunakan pun harus dalam kondisi aseptic. Tujuan utama dari sterilisasi ruangan maupun peralatan kultur pada dasarnya untuk menghindari kontaminasi oleh mikro organisme yang ada di peralatan maupun di udara bebas sekitar ruangan. Perlakuan tersebut mutlak dilakukan terutapa pada ruang penabur atau tempat yang digunakan untuk penanaman eksplan.

Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf. Autoklaf adalah alat yang digunakan untuk sterilisasi media mikrobiologi, peralatan gelas laboratorium, dan dekontaminasi untuk membunuh bakteri dengan menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi 121⁰C selama kurang lebih 15 menit.

Selain itu media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyarat untuk mendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Unsur yang berperan penting dan esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Media kultur tersebut terdiri dari unsur hara makro, mikro, sumber karbon (gula), vitamin dan asam amino serta zat pengatur tumbuh. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, agar, arang aktif, bahan organik .Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca Senyawa tersebut mempunyai arti penting untuk kelangsungan pertumbuhan tanaman yang dibudidayakan secara invintro (kultur jaringan). Ada dua penggolongan media tumbuh yaitu media padat dan media cair. Media padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti agar dan nutrisi dicampurkan pada agar. Sedangkan media cair adalah media dengan nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair digunakan untuk tujuan tertentu seperti pembentukan Protocorm Like Body (PLB) pada anggrek dan jahe. Faktor lain yang perlu diperhatikan pada media cair atau padat adalah Derajat Keasaman atau pH dari media kultur. Sel tanaman membutuhkan pH antar 5,5 sampai 5,8 oleh karena itu media harus diatur pHnya agar sesuai dengan pertumbuhan sel tanaman.

Media kultur in vitro juga memerlukan pertimbangan tertentu dalam campuran mineral, gula, vitamin dan hormon tumbuh. Sebagai contoh untuk induksi pertumbuhan sel kalus media Murashige dan Skoog (MS) dapat ditambahkan hormones auksin 2,4 D untuk induksi tunas dapat ditambahkan hormone IAA, sedangkan untuk pertumbuhan plantet dapat ditambahkan IAA dan Kinetin pada media MS lengkap. Semua media MS hasil modifikasi dengan penambahan hormon atau vitamin tertentu dapat dibuat dalam bentuk cair maupu padat dengan menambahkan bahan pemadat seperti agar, ekstrak kentang dan ekstrak pisang. Kemudian jika media kultur telah dipastikan siap, maka teknik kultur jaringan siap dilakukan.

Metode kultur in vitro dalam bidang pertanian saat ini telah berkembang untuk usaha perbanyakan tanaman, perbaikan sifat atau seleksi, produksi bahan metabolit, pemeliharaan plasma nutfah dan transfer gen dalam biologi molekuler. Semua kegiatan tersebut memerlukan media buatan baik dalam bentuk cair maupun padat dengan memberikan formulasi kebutuhan nutrisi, protein dan hormon tumbuh dalam perbandingan yang sesuai. Pada praktikum ini akan dilakukan teknik kultur organ tanaman.

Bagian atau organ tanaman secara umun terdiri dari akar, batang, daun serta bagian reproduktif yang berupa bunga, buah atau biji. Bagian-bagian tanaman tersebut mampu untuk beregenerasi menjadi tanaman lengkap baik secara langsung maupun tidak langsung. Peristiwa ini terjadi karena tanaman mempunyaicsifat totipotensi sel, yaitu dalam satu sel mempunyai kemampuan untuk menjadi tanaman lengkap. Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional.

Macam-macam organ umumnya menunjukan kecepatan pembelahan sel yng berbeda pula. Faktor yang mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis tanaman dalam kultur in vitro antara lain mencakup genotip sumber bahan tanaman, media dan ZPT yang digunakan, kondisi lingkungan inkubasi, fisiologi jaringan dari eksplan secara optimal sehingga diperoleh tanaman lengkap. Kultur organ dengan bahan eksplan berupa pucuk tanaman yang sehat dan bebas virus mempunyai aspek praktis sebagai perbanyakan klon yang cepat dan bebas penyakit.

1.2 Tujuan

1. Mengenal kondisi steril pada semua komponen pekerjaan kultur jaringan

2. Mengetahui sterilisasi alat, media, bahan tanam dn lingkungan yang steril atau aseptik.

3. Mempelajari cara pembuatan media dengan baik dan benar

4. Mengenal perbedaan bermacam-macam media kultur jaringan

5. Mengetahui salah satu organ tanaman yang mampu beregenerasi menjadi tanaman lengkap

6. Mengenal berbagai macam organ tanaman dalam berdeferensiasi dan menghasilkan kalus.

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Teknik Aseptik dalam Pembiakan Kultur Jaringan

Kultur Jaringan adalah teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utamanya adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman, menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril. Teknik kultur jaringan pada saat ini telah berkembang menjadi teknik perkembangbiakan tanaman yang sangat penting pada berbagai spesies tanaman (Iswanto,2002).

a. Sterilisasi Ruang

Bagian dalam laminar air flow disemprot dengan alkohol 70%. Kemudian lampu ultraviolet (UV) dinyalakan selama 1 jam. Saat akan digunakan, lampu neon dan kipas dinyalakan (Zulkarnain, 2009).

b. Sterilisasi Alat

Alat-alat dissecting set dan glass ware yang akan digunakan dicuci terlebih dahulu dan dikeringkan kemudian dibungkus dengan kertas payung, sedangkan mulut botol ditutup dengan alumunium foil. Selanjutnya alat-alat disterilisasi di dalam autoclaf dengan suhu 121°C selama 15 menit. Proses inokulasi eksplan, alat-alat dissecting set disterilisasi dengan alkohol 96% dan dibakar dengan nyala api spiritus setiap kali akan digunakan di laminar air flow (Santoso, 2003)

c. Sterilisasi Media

Media yang digunakan adalah media Murashige and Skoog atau MS (lampiran 1) di masukkan ke dalam botol kultur dan disterilisasi dengan autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit (Suryowinoto, 1996).

d. Sterilisasi Eksplan

Sterilisasi permukaan eksplan daun terdiri dari 2 tahap sterilisasi yaitu sterilisasi tahap I yang dilakukan di ruang persiapan dan sterilisasi tahap II yang dilakukan di laminar air flow. Sterilisasi tahap I meliputi: Daun tembakau muda (daun ketiga sampai kelima dari pucuk) diambil dari green house dibilas dengan air mengalir hingga bersih. Sedangkan sterilisasi tahap II dilakukan setelah sterilisasi tahap I, meliputi: Daun direndam dalam larutan etanol 70% selama 25 detik, kemudian dibilas dengan aquades steril selama 5 menit, Kemudian dibilas dengan aquades steril selama 5 menit sebanyak 3 kali. Selanjutnya eksplan diambil dengan pinset dan ditiriskan pada cawan petri yang berisi kertas saring (George,1993).

Ada beberapa jenis ZPT yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman, namun efisiensi dan efektivitasnya berbeda terhadap jenis tanaman yang berbeda. Sebagai contoh, kinetin sangat efektif untuk kultur buku batang), sementara sitokinin konsentrasi rendah dapat memacu perkembangan tunas sedangkan konsentrasi tinggi merangsang penggandaan tunas. Auksin pada konsentrasi rendah dapat memacu pertumbuhan akar dan pada konsentrasi tinggi dapat merangsang pertumbuhan kalus. Dengan demikian, pengaturan zat pengatur tumbuh di dalam media sangat menentukan terhadap keberhasilan pertumbuhan dan perkembangan kultur. Dalam perbanyakan tanaman dibutuhkan pemilihan perbandingan konsentrasi auksin, sitokinin dan suplemen yang tepat, karena hal ini akan menentukan dalam derajat keberhasilan pembentukan tanaman baru (Nurwahyuni dan Elimasni,2006).

Kultur jaringan merupakan suatu teknik isolasi bagian tanaman, seperti jaringan, organ atau embrio, lalu dikultur pada medium buatan yang steril sehingga bagian tanaman tersebut mampu bergenerasi dan berdiferensiasi menjadi tanaman lengkap (Winata, 1987 dalam Zulkarnain, 2009). Metode kultur jaringan dapat menghasilkan tanaman baru dalam jumlah yang banyak dalam waktu yang relatif singkat, dimana tidak bergantung pada musim. Keunggulan lain dari kultur jaringan yaitu memperoleh sifat fisiologi Kultur Jaringan Tembakau dan morfologi sama persis dengan tanaman induknya (Hendaryono dan Wijayani, 1994). Sehingga penyediaan bibit akan selalu terpenuhi dan bibit yang akan disebar ke masyarakat bersifat persis dengan tanaman induknya (Desriatin, 2004)

2.2 Pembuatan Media dalam Pembiakan Kultur Jaringan

Cara membuat media yaitu bahan-bahan dimasukkan ke dalam gelas bekker mulai dari makro nutrien, mikro nutrien, besi, vitamin, ZPT berupa 0,5 ppm IBA dan 0,4 ppm BAP serta akuades sebanyak 100 ml, kemudian media diaduk dengan menggunakan stirer di atas hot plate sampai mendidih. Pemberian sukrosa pada media sesuai dengan perlakuan konsentrasi: 0 g/l, 10 g/l, 20 g/l, 30 g/l dan 40 g/l. Pengaturan pH dilakukan setelah pemberian sukrosa. Apabila pH kurang dari 5,7-5,8 maka dapat ditambah dengan NaOH, sedangkan bila pH lebih dari kisaran tersebut maka ditambah dengan HCl. Akuades ditambahkan sampai 500 ml, kemudian dimasukkan serbuk agar ke dalam labu Erlermeyer dan diaduk dengan menggunakan magnetic stirer sampai mendidih. Media selanjutnya dituang ke dalam botol kultur dan ditutup dengan alumunium foil (Sitorus, et al.,2011).

Bahan pemadat (gelling agents) merupakan salah satu komponen yang penting di dalam media kultur jaringan tanaman maupun mikroorganisme. Media yang dipadatkan secara sempurna dapat menjadi media yang baik untuk pertumbuhan jaringan tanaman maupun mikroorganisme, karena dapat memelihara proses biokimia dan fisiologisnya (Maliro dan Lameck, 2004). Bahan pemadat yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman adalah jenis agar standar khusus untuk kultur jaringan tanaman yang umumnya masih diimpor, misalnya merek Bacto, Oxoid atau Gelrite dan Phytagel (Priadi, et al.,2008).

Keuntungan menggunakan bahan pemadat standar (agar) pada kultur jaringan tanaman adalah karena mempunyai warna yang lebih terang daripada bahan pemadat alternatif. Namun penggunaan agar standar pada perbanyakan secara massal akan meningkatkan biaya produksi secara signifikan. Hal ini sangat perlu diperhatikan karena di antara komponen penyusun media, biaya bahan pemadat dapat mencapai sekitar 70%, sedangkan komponen lain seperti garam-garam mineral, gula dan zat pengatur tumbuh hanya sedikit berpengaruh terhadap biaya produksi karena harganya relatif murah (Prakash et al., 2004). Pada Tabel 3 disajikan perbandingan harga beberapa jenis bahan pemadat media standar kultur jaringan tanaman dengan bahan pemadat media yang digunakan pada penelitian ini (Salisbury dan Ross,1995).

Salah satu kendala penggunaan bahan pemadat impor di negara sedang berkembang seperti Indonesia adalah harganya yang mahal, dan kadang kala memerlukan waktu yang relatif lama untuk memperolehnya. Hal ini mendorong para peneliti di negara berkembang untuk mencari bahan pemadat alternatif dari berbagai tumbuhan umbi-umbian dan sereal, misalnya dari pati ubi kayu dan guar gum (diisolasi dari endosperma Cyamopsis tetragonoloba), isubgol (diisolasi dari kulit biji Plantago ovata) dan tepung maizena, serta menggunakan bahan tanaman anggrek, kentang, ubi kayu dan sebagainya (Priadi, et al.,2008).

Media tanam memberikan pengaruh yang besar terhadap keberhasilan kultur jaringan. Dalam media tanam kultur jaringan terdapat penambahan zat pengatur tumbuh. Tanaman membutuhkan zat pengatur tumbuh alami (fitohormon) untuk proses pertumbuhan, yaitu zat pengatur tumbuh auksi dan sitokinin. Zat pengatur tumbuh berfungsi merangsang pertumbuhan, misalnya pertumbuhan akar, tunas, perkecambahan dan sebagainya. Zat pengatur tumbuh golongan auksin terdiri dari Indo Asam Asetat (IAA), Indol Asam Butirat (IBA), Naftalen Asam Asetat (NAA), dan 2,4 D. Zat pengatur tumbuh golongan sitokinin terdiri dari Kinetin, Zeatin, Ribosil, dan Bensil Aminopurin (BAP). Dalam pertumbuhan jaringan, sitokinin bersamansama dengan auksin memberikan pengaruh interaksi terhadap deferensiasi jaringan. Komposisi auksin dan sitokinin dalam media kultur in vitro memainkan peranan penting dalam induksi dan regenerasi kalus menjadi tunas Sedangkan konsentrasi 2 : 3 pada penelitan lain hanya mampu menginduksi kalus dan tunas pada varietas yang berbeda. Mengacu pada penelitian tersebut, maka dilakukan penelitian dengan berbagai konsentrasi yaitu 0 - 2,5 ppm untuk IAA dan 0 – 4 ppm untuk Kinetin. Penelitian ini bertujuan mendapatkan kombinasi konsentrasi IAA dan Kinetin yang efektif untuk induksi morfogenesis eksplan daun tembakau Nicotiana tabacu (Desriatin, 2004).

Teknik kultur jaringan tumbuhan atau kultur in vitro dapat dijadikan sebagai alternatif pemecahan masalah bagi perbanyakan bibit dan perolehan metabolit sekunder dari tanaman ini. Teknik ini dapat menghasilkan metabolit sekunder dalam jaringan tanaman dan juga dalam sel-sel yang dipelihara pada media buatan secara aseptik (Fitriani, 2003). Metabolit sekunder bisa diperoleh melalui kultur kalus. Metabolit yang dihasilkan dari kalus sering kali kadarnya lebih tinggi dari pada metabolit yang diambil langsung dari tanamannya. Salah satu cara yang dapat dilakukan untuk meningkatkan pertumbuhan kalus adalah dengan menambahkan pra zat ke dalam media. Media kultur jaringan tumbuhan berisi garam-garam mineral, hormon, vitamin, sumber karbon, dan asam amino. Smith (1992) menyatakan pemilihan media kultur jaringan merupakan kunci sukses dalam kultur jaringan. Hal ini menyebabkan banyak diadakan penelitian untuk memodifikasi media-media yang memberikan respon berbeda terhadap berbagai macam tanaman (Sitorus, et al.,2011).

2.3 Kultur Organ dalam Pembiakan Kultur Jaringan

Upaya peningkatan produktivitas dengan cara perbanyakan secara in vitro baik pada organ vegetatif maupun pada organ generatif yaitu dengan teknik kultur jaringan. Kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian tanaman, seperti protoplasma, sel, kelompok sel, jaringan, dan organ serta menumbuhkan dalam kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan bersegrerasi menjadi tanaman lengkap kembali (Djapfar, 1990).

Bagian tanaman yang digunakan untuk kultur jaringan biasanya adalah jaringan yang masih muda yang berasal dari organ vegetatif seperti akar, batang, dan daun maupun organ generatif seperti embrio, biji, anther, atau ovul serta bagian lain dari bunga. Keberhasilan kultur in vitro ditentukan oleh media dan macam tanaman. Media mempunyai 2 fungsi utama, yaitu untuk mennyuplai nutrisi dan untuk mengarahkan pertumbuhan melalui zat pengatur tumbuh. Adanya variasi media untuk tanaman menimbulkan beberapa macam media yang digunakan untuk kultur yaitu Murashige dan Skoog, Gamborg (B5), Linsmaier, Nitsch dan Nitsch, Woddy Plant Medium (WPM), MS, dan lain-lain. Media MS paling banyak digunakan terutama untuk tanaman hortikultura (Prihardini, et al., 1993).

Saat ini teknik perbanyakan tanaman melalui kultur in vitro telah banyak diterapkan pada tanaman pangan industri salah satunya pada tanaman pisang (Musa paradisiaca L.) karena Abaca secara morfologi tidak jauh berbeda dengan pisang lainnya, maka teknik kultur in vitro dimungkinkan dapat menghasilkan bibit-bibit Abaca yang seragam dan berproduksi tinggi. Para petani penanam pisang Abaca sangat menyukai bibit pisang hasil kultur jaringan karena bila dibandingkan dengan bibit asal biji atau anakan biasa, bibit pisang hasil kultur jaringan pertumbuhannya lebih pesat, seragam, dapat disediakan dalam jumlah banyak dengan waktu yang singkat, dan bebas patogen berbahaya (Avivi dan Irarwati,2004).

Perbanyakan tanaman secara in vitro atau yang lebih dikenal dengan kultur jaringan terbukti dapat meningkatkan ketersediaan bibit tanaman dalam jumlah besar dan seragam dalam waktu relatif singkat. Aplikasi teknologi ini telah banyak dilakukan terhadap berbagai spesies tanaman, diantaranya seperti yang dilakukan oleh Hutami (1998) untuk perbanyakan tanaman nilam khimera, Mariska (1998) dalam upaya penyediaan benih tanaman jahe dan Kosmiatin (2005) dalam upaya perbanyakan gaharu. Telah dilakukan penelitian terkait media kultur jaringan untuk family orchidaceae terutama genus Dendrobium. Widiastoety (1994) melaporkan bahwa penambahan 150 ml air kelapa sangat berpengaruh terhadap pembentukan protocorm like bodies (plb). Widiastoety (1995) meneliti tentang pengaruh berbagai sumber dan kadar karbohidrat terhadap pertumbuhan planlet anggrek Dendrobium, dilaporkan bahwa penggunaan karbohidrat dengan kadar 10 gr/ l terbukti efektif mempercepat pertumbuhan batang, daun dan akar planlet Dendrobium. Widiastoety (1997) melaporkan bahwa pemberian air kelapa sebanyak 150 ml/l pada tingkat ketuaan kelapa muda dan sedang dapat mendorong pertumbuhan planlet anggrek Dendrobium (Oktafiani,2001).

BAB 3. METODOLOGI

3.1 Tempat dan Waktu

Praktikum pembiakan tanaman 1 dengan judul acara Kultur Jaringan dilaksanakan di laboratorium produksi tanaman Fakultas Pertanian Universitas Jember pada hari kamis jam 14:00 wib tanggal 2 April 2012.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

1. Pinset

2. Gunting

3. Scalpel

4. Jarum ose

5. Petridish

6. Botol kultur dan gelas

7. Autoklaf

8. Shaker/alat penggojok

9. Oven

10. Laminer air flow

11. Kotak entkas

12. Timbangan analitis

13. Alat pengukur pH

14. Erlenmeyer

15. Gelas ukur

16. Beaker glass

17. Tabung reaksi

18. Thermometer

3.2.2 Bahan

1. Bahan media

2. Biji jagung dan lain-lain

3. Bahan media kultur

4. Daun kakao dan zygot jagung

5. Bahan media kultur

6. Bahan kultur organ tanaman

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Teknik Aseptik dalam Pembiakan Kultur Jaringan

A. Sterilisasi Peralatan

1. Mencuci semua peralatan tanam yang digunakan dalam kultur in vitro dengan detergen

2. Membilasnya sampai bersih, pembilasan terakhir dengan menggunakan aquades

3. Meniriskan/mengering anginkan untuk selanjutnya mengoven selama 4 jam dengan temperatur 160⁰C

4. Peralatan pinset, gunting, scalpel, jarum ose, petridish, dan lain-lain. Sebelum mengoven, terlebih dahulu membungkusnya dengan kertas coklat/koran

5. Mengoven peralatan botol kultur dan gelas

6. Setelah selesai sterilisasi, semua peralatan bisa digunakan dengan harapan menekan kontaminasin.

B. Sterilisasi Media

1. Pada kultur in vitro, media tanam yang dipergunakan adalah media steril. Sterilisasi media sangat diperlukan sebagai upaya menghindari kontaminasi selama kultur

2. Teknik sterilisasi yang digunakan berupa sterilisasi basah dengan autoclave

3. Memasukkan media yang telah terbuat ke dalam botol kultur

4. Metutup dengan kertas aluminium foil

5. Melakukan sterilisasi selama 20-30 menit pada temperatur 121⁰C dengan tekanan 17,5 psi.

C. Sterilisasi Bahan Tanam

Bahan tanam dapat berasal dari lapang, rumak kaca dan dari kultur yang sudah steril. Eksplan dari lapang mempunyai tingkat kontaminasi lebih tinggi dibandingkan yang berasal dari rumah kaca. Eksplan tersebut berupa potongan tunas muda, batang, daun, akar, umbi, rimpang, dan lain-lain. Cara sterilisasi eksplan yang akan ditanam berbeda-beda tergantung dari jenis tanaman, bagian tanaman yang digunakan.

Teknik sterilisasi dapat dilakukan sebagai berikut :

1. Mencuci bersih dengan air mengalir

2. Menggojog dengan pestisida/fungisida

3. Merendam dengan bahan kimia tertentu/antiseptik di laminar air flow

4. Membilas dengan air steril, kemudian menanamnya

Contoh sterilisasi embrio jagung :

1. Menyiapkan biji jagung muda

2. Menggojog biji jagung dalam larutan Dithane 45 2g/l selama 30 menit kemudian membilasnya dengan air steril di dalam laminar

3. Menggojog biji jagung (dengan tangan) dalam larutan clorox 20% dan menambahkan 5 tetes Tween selama 3 menit kemudian membilas dengan air steril 3 kali, mengulangi lagi tanpa menggunakan Tween sampai busanya tidak muncul

4. Mengambil embrio jagung dari dalam bijinya, dan memasukkan dalam air steril

5. Meniriskan embrio jagung di atas tissue steril

6. Menanam embrio di media yang sudah disiapkan

3.3.2 Pembuatan Media dalam Pembiakan Kultur Jaringan

A. Cara membuat stok larutan dengan volume 1 liter, contoh :

1. Membuat stok KNO₃525 mg/lt sebanyak 1 lt dengan pegambilan 20 ml

Berapa KNO₃yang ditimbang?

Jawabannya :

N_{1 .}V₁= N_{2 .}V₂

N_{1 .}20 = 525 . 1000

N_{1 =}26250 mg

KNO₃ yang tertimbang sejumlah 26250 mg (26,25 g).

2. Melarutkan kedalam 1000 ml aquades.

3. Menyimpan kedalam suhu dingin.

B. Cara pembuatan media padat Vacin & Went (VW) kultur jaringan sebanyak 1 liter

1. Menyiapkan semua larutan baku VW

2. Mengambil larutan baku sesuai ketentuan dan menuang kedalam beaker glass 1 liter yang sudah terisi aquades 300 ml

3. Menimbang gula 20 g, 8 g bahan pemadat (agar) dan arang aktif 1 g memasukkan dalam beaker glass. Mengaduk campuran di atas stirer dan mengukur derajat keasaman dengan pH meter (5,8), menggunakan NaOH 1N atau HCL 1N untuk mengaturnya

4. Menambahkan aquades hingga mencapai 1000 ml

5. Mendidihkan di atas api sampai agar melarut

6. Menuangkan media selagi cair ke dalam botol-botol dengan ukuran ketebalan 1 cm

7. Menutup semua botol dengan alumunium foil, dan memberi tanda menurut jenis medianya

8. Mensterilkan botol-botol berisi media di dalam autoclave selama 30 menit temperatur 121⁰C tekanan 17,5 psi

3.3.3 Kultur Organ dalam Pembiakan Kultur Jaringan

Melakukan penanaman dengan berbagai macam bahan/organ tanam yang berbeda, antara lain : anggrek, embrio jagung, umbi bawang merah.

A. Organ Tanaman Embrio Jagung

1. Menyiapkan biji jagung muda.

2. Menggojog biji jagung dalam larutan Dithane 45 2 g/l selama 30 menit kemudian membilasnya dengan air steril di dalam laminar.

3. Menggojog biji jagung (dengan tangan) dalam larutan clorox 20 %.

4. Menambahkan 5 tetes Tween selama 3 menit.

5. Membilas dengan air steril 3 kali, mengulangi lagi tanpa menggunakan Tween sampai busanya tidak muncul.

4. Mengambil embrio jagung dari dalam bijinya, dan memasukkan dalam air steril.

5. Meniriskan embrio jagung di atas tissue steril.

6. Menanam embrio pada media yang sudah di siapkan.

B. Organ Tanaman Umbi Bawang Merah

1. Menyiapkan umbi bawang merah.

2. Mengupas kulit luarnya.

3. Menggojog dengan larutan clorox 20 % dan menambahkan 5 tetes Tween selama 3 menit.

4. Membilas dengan air steril 3 kali, mengulangi lagi tanpa menggunakan Tween sampai busanya tidak muncul.

5. Memperkecil ukuran umbi bawang merah dengan membuang seludang kulit luarnya.

6. Memotong umbi bawang merah secara transfersal.

7. Menanam pada media yang sudah disediakan.

C. Organ Tanaman Anggrek

1. Menyiapkan media VW kosong dan kultur anggrek dalam laminar

2. Memindah tanaman anggrek yang sudah berjejal ke media baru (sub kultur)

3. Menyimpan kembali ke rak inkubasi

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Berdasarkan praktikum acara Kultur Jaringan diperoleh tabel hasil pengamatan media dan eksplant

No	Tanggal	Media	Kelompok	Kontaminan	Tidak Kontaminan	Keterangan
No	Tanggal	Media	Kelompok	Kontaminan	Tidak Kontaminan	Keterangan
1	4 April 2012	IBA 1 ppm	1	—	√	—
		IBA 1 ppm	3	—	√	—
		BAP 1 ppm	2	—	√	—
		BAP 1 ppm	6	—	√	—
		IBA ½ ppm + BAP ½ ppm	4	—	√	—
		IBA ½ ppm + BAP ½ ppm	5	—	√	—
2	9 April 2012	IBA 1 ppm	1	—	√	—
		IBA 1 ppm	3	—	√	—
		BAP 1 ppm	2	—	√	—
		BAP 1 ppm	6	—	√	—
		IBA ½ ppm + BAP ½ ppm	4	—	√	—
		IBA ½ ppm + BAP ½ ppm	5	—	√	—

Tabel 1. Hasil pengamatan media kultur jaringan

No	Tanggal	Eksplant	Ul	Pertumbuhan		Kontaminasi	Tidak Kontaminasi	Keterangan
No	Tanggal	Eksplant	Ul	Jmlh Akar	Jmlah Tunas	Kontaminasi	Tidak Kontaminasi	Keterangan
1	4 April 2012	Jagung	1	2	2	—	√	—
		Jagung	2	1	1	—	√	—
		Bawang Merah	1	1	1	—	√	—
		Bawang Merah	2	1	1	—	√	—
		Anthurium	1	—	—	—	√	—
		Anthurium	2	—	—	—	√	—
2	9 April 2012	Jagung	1	4	1	—	√	—
		Jagung	2	3	3	—	√	—
		Bawang Merah	1	11	3	√	—	Jamur
		Bawang Merah	2	13	6	—	√	—
		Anthurium	1	—	—	√	—	Jamur
		Anthurium	2	—	—	√	—	Jamur

Tabel 2. Hasil pengamatan eksplan kultur jaringan

4.2 Pembahasan

Kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti sekelompok sel atau jaringan yang ditumbuhkan dengan kondisi aseptik, sehingga bagian tanaman tersebut dapat memperbanyak diri tumbuh menjadi tanaman lengkap kembali. Teknik kultur jaringan memanfaatkan prinsip perbanyakan tumbuhan secara vegatatif. Berbeda dari teknik perbanyakan tumbuhan secara konvensional, teknik kultur jaringan dilakukan dalam kondisi aseptik di dalam botol kultur dengan medium dan kondisi tertentu.

Sterilisasi adalah segala proses dimana suatu objek, material atau lingkungan dijadikan steril. Steril merupakan kondisi benda atau objek yang bebas dari segala jenis sel hidup, spora dan virus. Metode sterilisasi dapat dikategorikan menjadi 3, yaitu metode fisik, metode kimia, dan kombinasi fisik dan kimia. Metode fisik antara lain mencakup pemanasan, pembakaran, penyaringan, penggunaan radiasi, dan penggunaan gelombang ultrasonik. Pemanasan adalah metode yang paling lazim digunakan.

Pada praktikum ini sterilisasi meliputi sterilisasi lingkungan kerja, sterilisasi alat, media dan sterilisasi bahan tanam. Sterilisasi yang dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan peralatan seperti Laminar Air Flow ataupun Autoclave. Selain menggunakan alat sterilisasi, supaya mikroorganisme benar-benar hilang maka dapat digunakan senyawa kimi seperti dengan etanol, alkohol taupun aquadest yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan selain itu teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril. Sterilisasi pada teknik kultur jarngan meliputi:

1. Sterilisasi Lingkungan Kerja

Dalam penanaman eksplan memerlukan tempat atau ruang yang steril dan bebas mikroorganisme. Tempat untuk menanam dan memindahkan eksplan disebut dengan Laminar Air Flow Cabinet. Alat-alat yang digunakan dalam kultur jaringan biasanya ditempatkan diruangan dengan aliran udara halus yang dihembuskan dari blower melalui suatu filter HEPA ( High Efficiency Particulate Air) dengan pori-pori <0,3 µm. Aliran udara ini dapat mencegah kontaminan selama penanaman.

2. Sterilisasi Alat dan Media

Pada praktikum ini alat-alat yang digunakan adalah pinset, gunting, scalpel, jarum, ose, petridish, botol kultur dan gelas, autoklaf, shaker atau alat penggojok, oven, laminer air flow, kotak entkas, timbangan analitis, alat pengukur pH, erlenmeyer, gelas ukur, beaker glass, tabung reaksi, thermometer. Sebelum disterilisasi alat-alt tersebut dicuci dengan detergen saat praktikum pendahuluan dalam serangkaian acara kultur jaringan. Kemudian peralatan tersebut disimpan dalam ruangan dengan suhu 121⁰C pada tekanan 17,5 psi selam 20-30 menit. sedangkan sterilisasi dengan oven menngunakan temperatur 150⁰C selama 4 jam.

3. Sterilisasi Bahan Tanam

Bahan tanam yang digunakan dalam praktikum ini harus disterilkan dahulu agar tingkat keberhasilan kultur semakin tinggi. Pada praktikum ini bahan tanam yang digunakan adalah eksplan dari embrio jagung, umbi bawang merah dan sel anthurium. Bahan-bahan tanam tersebut sebelumnya telah disterilisasi dengan cara yang berbeda tetapi secara garis besar tahap sterilisasi bahan-bahan tersebut adalah sebagai berikut :

1. Mencuci bersih ke-3 bahan media tanam tersebut dengan alir mengalir.

2. Menggojognya dengan pestisida atau fungisida

3. Merendamnya dengan bahan kimia aseptik di laminar air flow

4. Membilasnya dengan air steril.

5. Mengambil sel, organ atau bahan utama yang akan dikultur dengan peralatan steril. Contoh mengambil embrio dari jagung.

Sebenarnya setiap tanaman mempunyai tingkat kontaminasi yang berbeda tergantung pada jenis tanaman, bagian tanaman yang digunakan, morfologi organ tersebut, mutu tanaman dan kondisi tanaman. Prinsip utama sterilisasi bahan tanam atau eksplan dalam kultur jaringan adalah mematikan kontaminan tanpa membunuh eksplan, karena baik eksplan maupun kontaminan adalah makhluk hidup.

Dari berbagai teknik aseptik yang dilakukan dalam praktikum ini terutama pada saat menanam eksplan ke dalam botol dalam kondisi steril dilakukan didalam alat yang disebut dengan Laminar Air Flow. Laminar Air Flow adalah alat sterilisasi yang menggunakan prinsip filtrasi udara dan penggunaan radiasi ultraviolet. Laminar air flow digunakan sebagai tempat untuk melakukan kegiatan laboratorium yang membutuhkan kondisi steril, seperti membuka alat yang telah disterilisasi dan menyiapkan samel mikrobia. Lingkungan dalam laminar air flow disterilisasi dengan 2 cara. Sebelum digunakan, laminar air flow ditutup dan lampu UVR dinyalakan sehingga mikrobia di udara dan permukaan ruang mati, lalu saat bekerja, kondisi udara dijaga stabil dengan filtrasi udara. Komponen laminar air flow antara lain ruang kaca steril yang dilengkapi dengan tutup, filter udara di bagian belakang, lampu UV di langit-langit ruang, lampu biasa untuk membantu proses kerja, serta panel tombol untuk menyalakan lampu UVR, filter dan lampu biasa.

Gambar 1. Laminar Air Flow di laboratorium Kultur Jaringan (kanan) dan cara kerja dari Laminar Air Flow (kiri).

Laminar Air Flow (LAF) merupakan alat yang sering digunakan untuk bekerja secara aseptis, alat ini mempunyai pola pengaturan dan penyaring aliran udara sehingga menjadi steril dan dilengkapi dengan blower serta lampu UV.

Prosedur penggunaan LAF adalah sebagai berikut:

1. Menghidupkan lampu UV selama 2 jam, selanjutnya mematikan segera sebelum mulai bekerja.

2. Memastikan kaca penutup terkunci.

3. Menyalakan lampu neon dan blower.

4. Membiarkan selama 5 menit.

5. Mencuci tangan dan lengan dengan sabun atau alkohol 70 %, sebelum menggunakan LAF.

6. Memasukkan alat dan bahan yang akan dikerjakan, mengusahakan agar tidak terlalu penuh (overload) karena memperbesar resiko kontaminan.

7. Mengatur alat dan bahan yang telah dimasukan ke LAF sedemikian rupa sehingga efektif dalam bekerja dan tercipta areal yang benar-benar steril

8. Menghindari penggunaan api atau pembakar bunsen dengan bahan bakar, tetapi didalam LAF diperbolehkan menyimpan larutan-larutan yang berbahaya.

9. Mengerjakan secara aseptis dan mengusahakan jangan sampai pola aliran udara terganggu oleh aktivitas kerja.

Alat lain yang berperan penting dalam teknik aseptik, terutama sterilisasi alat dan media tanam adalah Autoclave. Autoclave yaitu alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam teknik kultur jaringan dengan prinsip utama menghilangkan kontaminasi dengan menggunakan uap air panas bertekanan tinggi. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121^oC (250^oF). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi² (15 Psi = 15pounds per square inch). Medium yang akan disterilkan ditempatkan di dalam autoclave selama 15-20 menit, hal ini bergantung pada banyak sedikitnya barang yang perlu disterilkan. Medium yang akan disterilkan ditempatkan dalam beberapa botol yang agak kecil daripada dikumpul dalam satu botol yang besar. Setelah pintu autoclave ditutup rapat, barulah kran pada pipa uap dibuka dan temperatur akan terus-menerus naik sampai 121^oC .

Gambar 2. Autoclave di laboratorium Kultur Jaringan (kiri) dan keterangan bagian-bagian dari autoclave (kanan).

Keterangan gambar autoclave :

1. Tombol pengatur waktu mundur (timer).

2. Katup pengeluaran uap.

3. pengukur tekanan.

4. kelep pengaman.

5. Tombol on-off.

6. Termometer.

7. Lempeng sumber panas.

8. Aquades (dH₂O).

9. Sekrup pengaman.

10. batas penambahan air.

Cara menggunakan autoclave adalah sebagai berikut :

1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut.Menggunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.

2. Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol beretutup ulir, maka tutup harus dikendorkan.

3. Kemudian menutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoklaf. Mengusahakan agar klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu.

4. Menyalakan autoklaf lalu mengatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121^oC.

5. Menunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian menutup dan mengencangkan klep pengaman setelah itu menunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 15 menit dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm.

6. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka masih menunggu tekanan dalam kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian membuka klep-klep pengaman dan mengeluarkan isi autoklaf dengan hati-hati.

Selain berbagai alat yang digunakan dalam teknik aseptik kultur jaringan, terdapat faktor lain yang mempengaruhi keberhasilan sterilisasi baik alat dan media maupun bahan tanam yaitu bahan kimia yang digunakan untuk sterilisasi.

Menurut Salisbury (1995) Penggunaan formalin tidak dibenarkan sama sekali, karena uap formalin dapat terhembus kearah dada sipenabur sehingga berbahaya bagi kesehatannya. Strerilisasi pada laminar air flow yang dibenarkan adalah dengan spirtus atau alkohol 70% . Oleh karena itu dalam berbagai teknik kultur jaringan hanya beberapa senyawa kimia yang digunakan untuk menghilangkan kontaminasi mikrobia, diantaranya adalah alkohol, spiritus, khlorin, dhitane dan tween. Sebelum mulai bekerja, permukaan tempat kerja dari laminar air flow dilap dengan kapas yang telah dicelup dalam 70% alkohol atau dalam larutan kaporit. Ada juga tipe laminar air flow yang dilengkapi dengan lampu ultra violet. Maka lampu ultra violet dinyalakan selama beberapa waktu antara 1-2 jam untuk mematikan kontaminan dipermukaan tempat kerja. Laminar air flow juga harus dijaga sebersih mungkin. Setelah bekerja, permukaan tempat kerja dibersihkan dengan alkohol 70% atau dengan lampu ultra violet selama 1-2 jam.

Pembiakan secara kultur jaringan merupakan teknik memperoleh tanaman baru yang lebih cepat dibanding teknik lain, tetapi jika berhasil. Pada umumnya teknik kultur jaringan sering mengalammi kegagalan. Pada praktikum ini terdapat beberapa eksplan yang justru ditumbuhi oleh jamur, hal itu menunjukkan bahwa organ tanaman tersebut telah terkontamintasi. Sumber kontaminasi dapat berasal dari eksplan tumbuhan, organisme kecil yang masuk ke dalam media, alat yang tidak steril dan lingkungan kerja yang kurang steril. Kontaminasi pada praktikum ini terjadi pada eksplan bawang merah dan anthurium dan keduanya terkontaminasi sama yaitu oleh jamur. Pada praktikum ini terdapat dua organisme yang diduga menyebabkan kontaminasi pada eksplan yaitu bakteri dan jamur. Perbedaan utama kontaminasi yang disebabkan oleh jamur dan bakteri adalah sebagai berikut :

1. Kontaminasi Bakteri

Jika media kultur jaringan terkontaminasi oleh bakteri, maka akan terdapat lendir dan lama-kelamaan media tanam yang seharusnya padat akan mencair kembali.

2. Kontaminasi Jamur

Berbeda dengan kontaminasi oleh bakteri, jika eksplan atau media kultur jaringan terkontaminasi oleh jamur, maka akan terlihat jamur atau fungi. Kontaminasi oleh jamur adalah yang paling sering terjadi, seperti pada praktikum ini eksplan bawang merah dan anthurium terkontaminasi oleh jamur. Dalam gelas wadah eksplan terdapat jamur yang menempel pada eksplan, dengan warna hitam dan berkoloni. Maka teknik kultur jaringan pada eksplan bawang merah dan anthurium dinyatakan gagal karena terkontaminasi oleh jamur. B

Menurut George (1993) kultur yang telah terkontaminasi dapat diselamatkan dengan metode berikut:

1. Buka wadah yang berisi kultur terkontaminasi dan isi penuh dengan larutan 0.5–1% w/v sodium hypochlorite.

2. Biarkan selama 1–50 menit tergantung pada keganasan kontaminasi atau sensitivitas bahan tanaman.

3. Keluarkan kultur dari larutan kloring, potong bagian dasar dan buang daun – daun yang berlebihan

4. Transfer ke media kultur yang baru

Tahap selanjutnya, eksplan dapat dicuci dengan air steril atau diperlalukan dengan satu seri sodium hypochlorite encer, misalnya 1% → 0.5% → 0.25% → 0.1% dan ditanam tanpa pembilasan dengan air steril lagi. Ini berarti tanaman yang ditanam kembali ke kultur mengandung sedikit klorin. Senyawa klorin berguna pada kultur yang terkontaminasi berat, tetapi hanya tanaman yang tahan klorin yang dapat diperlakukan dengan cara ini. Dengan metode tersebut, kultur yang terkontaminasi akan segera membaik dan tumbuh.

Setelah praktikan mengerti tentang semua hal mengenai teknik aseptik maka tahap selanjutnya adalah pembuatan media kultur jaringan. Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan tanaman dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media kultur baik padat maupun cair seharusnya menyediakan unsur hara dan mikro maupun makro, vitamin, asam amino, karbohidrat, zat pengatur tumbuh. Pada praktikum ini media yang digunakan adalah jenis media padat dengan komposisi unsur-unsur sebagai berikut :

1. Stok hara makro

Senyawa hara makro diperlukan dalam jumlah yang cukup besar. Oleh karena itu dibuat dalam stok larutan tunggal selain itu jenis anion senyawa makro tidak sama. Unsur hara makro merupakan kebutuhan pokok pertumbuhan tanaman. Setiap unsur hara memiliki fungsi dan perannya masing-masing dalam memenuhi kebutuhan eksplan agar dapat berkembang menjadi individu baru.

1. Unsur Nitrogen (N)

Kegunaan unsur Nitrogen bagi tanaman adalah untuk menyuburkan tanaman, sebab unsur N dapat membentuk protein, lemak dan berbagai persenyawaan organik yang lain.

2. Unsur Fospor (P)

Dibutuhkan oleh tanaman untuk membentuk karbohidrat. Maka, unsur P ini dibutuhkan secara besar-besaran pada waktu pertumbuhan benih.

3. Unsur Kalium (K)

Memperkuat untuk tubuh tanaman, karena unsur ini dapat digunakan untuk memperkuat serabut-serabut akar, sehingga daun, bunga dan buah tidak mudah gugur.

4. Unsur Sulpur (S)

Unsur ini digunakan untuk proses pembentukan anakan sehingga pertumbuhan dan ketahanan tanaman terjamin.

5. Unsur Kalsium (Ca)

Digunakan untuk merangsang pembentukkan bulu-bulu akar, mengeraskan batang dan merangsang pembentukkan biji.

6. Unsur Magnesium (Mg)

Digunakan tanaman sebagai bahan mentah untuk ppembentukkan sejumlah protein.

7. Unsur Besi (Fe)

Unsur ini digunakan sebagai penyangga (chelati agint) yang sangat penting untuk menyagga kestabilan pH media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan tanaman.

8. Unsur Sukrosa

Unsur ini sering ditambahkan pada medium kultur jaringan sebagai sumber energi yang diperlukan untuk induksi kalus.

9. Unsur Glukosa atau Fruktosa

Unsur ini dapat digunakan sebagai unsur pengganti sukrosa karena dapat merangsang beberapa jaringan.
2. Stok hara mikro

Unsur hara mikro sangat sedikit diperlukan dalam pembuatan media. biasanya larutan hara mikro dibuat dengan kepekatan 200 kali konsentrasi akhir media dan bahan yang diperlukan masih cukup kecil jumlahnya. Oleh karena itu larutan stok unsur hara mikro dapat dibuat sebagai stok campuran. Tetapi meskipun dibutuhkan dalam jumlah kecil unsur hara mikro merupakan penyusun protein sel tanaman yang berperan dalam proses metabolisme dan fisiologi tanaman. Unsur hara mikro meliputi Fe, Zn, B, Cu, Co, dan Mo.

3. Zat Pengatur Tumbuh

Kebutuhan zat pengatur tumbuh untuk kebanyakan kultur kalus adalah auksin dan sitokinin. Auksin merupakan senyawa yang dibutuhkan untuk menginduksi pembelahan sel, pemanjangan sel, dan seringkali untuk pengakaran. Senyawa auksin sering digunakan bersamaan dengan sitokinin. Pada umumnya sitokinin merupakan turunan adenin (aminopurin), yang mempunyai peranan menginduksi tunas, mendorong pembelahan sel jaringan tanaman, mengatur pertumbuhan dan perkembangan seperti kinetin. Auksin yang sering digunakan adalah IAA, IBA dan sitokinin yang sering digunakan adalah BAP.

Pada praktikum ini ZPT yang digunakan adalah IBA dan BAP dengan konsentrasi yang berbeda yaitu IBA 1 ppm, BAP 1 ppm, IBA ½ ppm dan BAP ½ ppm. Indole-3-Butyric (IBA) hampir sama dengan Asam Indole Asetat (IAA) yang dapat memacu pertumbuhan akar, batang dan daun. IBA berbentuk tepung berwarna putih, IBA tidak dapat dicairkan dengan air biasa tetapi dengan larutan alkali dan karbon.

4. Vitamin

Vitamin mempunyai fungsi katalisator dalam sistem enzim dan dibutuhkan hanya dalam jumlah sangat sedikit. Tiamin (vit B1) dipandang sebagai satu-satunya vitamin penting untuk hampir semua kultur jaringan tanaman, sedangkan niacin dan pyridoxine (vit B6) dapat memacu pertumbuhan. Thiamin yang diberikan berupa Thiamin –HCl.

5. Asam amino

Asam amino biasanya tidak ditambahkan pada media kultur tanaman, kecuali glisin. Asam amino dapat mendorong pertumbuhan sel dan regenerasi tanaman. Apabila suatu campuran nitrogen organik diperlukan, medium dpat diperkaya dengan casein hidrosilat. Asam amino khusus kadang-kadang diperlukan untuk menginduksi respon fisiologis.

6. Karbohidrat

Semua media memerlukan karbohidrat sebagai sumber karbon dan energi. Hampir semua kultur menghasilkan pertumbuhan optimum dengan penambahan disakarida sukrose, namun akan diperoleh keragaman pertumbuhan apabila ditambahkan disakarida yang lain atau monosakarida sebagai pengganti sukrose.

7. Air

Air yang digunakan pada semua kultur jaringan, termasuk air yang digunakan selama pembuatan kultur harus didestilasi. Tidak dianjurkan menyimpan air destilasi dalam wadah polietilen atau gelas pyrex karena dapat terkontaminasi dalam ruang penyimpanan yang tidak steril.

Teknik kultur jaringan akan berhasil dengan baik apabila syarat-syarat yang diperlukan terpenuhi. Syarat-syarat tersebut meliputi pemilihan eksplan sebagai bahan dasar untuk pembentukkan kalus, penggunaan media yang cocok dan keadaan yang aseptik. Oleh karena itu media kultur jaringan merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan kultur jaringan.

Ketika menentukan akan menanam apa dengan metode kultur jaringan, maka perlu pula menentukan media dasar apa yang akan dipakai. Ada beberapa jenis media dasar dalam kultur jaringan diantaranya adalah :

1. Media Knop

Konsep media ini adalah yang pertama ditemukan, yang dapat digunakan untuk menumbuhkan kalus wortel. Kultur kalus, biasanya ditumbuhkan pada media dengan kosentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam kultur akar dengan penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine, thiamine, cysteine-HCl dan IAA.

2. Media White

Media ini dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan tumor bunga matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih tinggi dari pada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S pada media untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan normal yang dikembangkan kemudian. Konsentrasi NO3- dan K+ yang digunakan Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi masih lebih rendah dari pada media-media lain yang umum digunakan sekarang.

3. Media Knudson dan media Vacin and Went,

Media ini dikembangkan khusus untuk kultur anggrek. Tanaman yang ditanam di kebun dapat tumbuh dengan baik dengan pemupukan yang hanya mengandung N dari Nitrat. Knudson pada tahun 1922, menemukan penambahan 7.6 mM NH4+ disamping 8.5 mM NO3-, sangat baik untuk perkencambahan dan pertumbuhan biji anggrek. Penambahan NH4+ ternyata dibutuhkan untuk perkembangan protocorm.

4. Media Nitsch & Nitsch,

Media yang menggunakan NO3- dan K+ dengan kadar yang cukup tinggi untuk mengkulturkan jaringan tanaman artichoke Jerussalem. Penambahan ammonium khlorida sebanyak 0.1 mM, menghasilkan pertumbuhan jaringan yang menurun. Mereka mengambil kesimpulan, bahwa NH4+ sangat menunjang pertumbuhan kalus .

5. Media Murashige & Skoog (media MS)

Merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM. Unsur makro lainnya konsemtrasinya dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan media MS, sehingga dikembangkan media-media lain berdasarkan media MS tersebut, antara lain media :

6. Media Gamborg B5 (media B5)

Pertama kali dikembangkan untuk kultur kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat dan amonium lebih rendah dibandingkan media MS. Untuk selanjutnya media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman.. Pada masa ini media B5 juga digunakan untuk kultur-kultur lain. Media ini dikembangkan dari

Beberapa media dasar yang banyak digunakan antara lain:
1. Media dasar Murhasige dan skoog (1962) yang dapat digunakan untuk hamper semua jenis kultur, terutama pada tanaman herbaceous.

2. Media dasar B5 untuk kultur sel kedelai, alfafa, dan legume lain.

3. Media dasar White (1934) yang sangat cocok untuk kultur akar tanaman tomat.
4. Media dasar Vacin dan Went yang biasa digunakan untuk kultur jaringan anggrek.
5. Media dasar Nitsch dan Nitsch yang biasa digunakan dalam kultur tepung sari (pollen) dan kultur sel.

6. Media dasar schenk dan Hildebrandt (1972) atau media SH yang cocok untuk kultur jaringan tanaman-tanaman monokotil.

7. Medium khusus tanaman berkayu atau Woody Plant Medium (WPM)
8. Media N6 untuk serealia terutama padi.

Dari sekian banyak media dasar yang paling sering dan banyak digunakan adalah komposisi media dari Murashige dan Skoog. Kadang-kadang untuk kultur tertentu, kombinasi zat kimia dari murashige dan Skoog masih tetap digunakan tetapi konsentrasinya yang diubah. Sebagai contoh media ½ MS, berarti konsentrasi persenyawaan yang digunakan adalah setengah konsentrasi media Murashige dan Skoog.

Pada praktikum pembuatan media kultur jaringan terdapat beberapa perbedaan perlakuan komposisi media. Tetapi perbedaan tersebut hanya sebatas digunakan dalam ketentuan jumlah hormon ZPT yang berbeda-beda. Untuk media yang dibuat oleh kelompok 1 dan 3 menggunakan media padat dengan perlakuan IBA 1 ppm. Kemudian kelompok 2 dan 6 menggunakan BAP 1 ppm dan terakhir kelompok 4 dan 5 menggunakan IBA ½ ppm dan BAP ½ ppm. Berdasarkan data hasil praktikum pada pengamatan hari ke-3 semua media dengan berbagai perlakuan berhasil, atau tidak terkontaminasi baik oleh jamur ataupun bakteri dan media-media tersebut telah memadat oleh bantuan agar. Media tersebut bertahan hingga hari ke-7, yaitu semua media tidak ada yang terkontaminasi. Semua perlakuan menunjukkan data yang sama, bahwa pada praktikum ini pembuatan media padat dengan berbagai komposisi semua media berhasil.

Pembuatan media pada prinsipnya dilakukan dengan melarutkan semua komponen media dalam air sesuai dengan konsentrasi pada formulasi yang ditentukan. Namun, penimbangan satu persatu komponen media untuk setiap pembuatan media kultur adalah tidak praktis dan hanya dapat dilakukan jika jumlah zatnya cukup besar. Masalah tersebut dapat diatasi dengan pembuatan larutan stok. Larutan stok adalah larutan berisi satu atau lebih komponen media yang konsentrasinya lebih besar dari konsentrasi komponen tersebut.

Murashige dan Skoog (1977) menyebutkan bahwa media kultur invitro memerlukan perimbangan tertentu dalam camupuran garam-garam mineral, gula, vitamin dan hormon tumbuh. Sebagai contoh untuk induksi pertumbuhan sel kalus media Murashige dan Skoog (MS) dapat ditambahkan hormon auksin 2, 4 D, untuk induksi tunas dapat ditambahkan hormon IAA, sedangkan untuk pertumbuhan planlet daat ditambahkan IAA dan Kinetin.

Semua media MS hasil modifikasi dengan penambahan hormon atau vitamin tertentu dapat dibuat dalam bentuk cair maupun padat dengan menambahkan bahan pemadat seperti agar. Komposisi media yang digunakan dalam kultur jaringan dapat berbeda komposisinya. Perbedaan komposisi media dapat mengakibatkan perbedaan pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang dutumbuhkan secara in vitro Media Murashige dan Skoog (MS) sering digunakan karena cukup memenuhi unsur hara makro, mikro dan vitamin untuk pertumbuhan tanaman. Nutrien yang tersedia di media berguna untuk metabolisme, dan vitamin pada media dibutuhkan oleh organisme dalam jumlah sedikit untuk regulasi.

Media Murashige & Skoog (MS) merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada eksplan kultur jaringan. Pada praktikum ini pembuatan media MS menggunakan stok larutan dengan KNO₃. Kebutuhan larutan stok media MS dapat disesuaikan dengan jenis eksplan yang dikulturkan. KNO₃ dihitung menggunakan rumus perbandingan massa dan volume yang kemudian dapat ditentukan massa dari KNO₃ yang kemudian dilarutkan dalam 1000 ml aquades dan disimpan dalam suhu dingin. Unsur Nitrogen (N) bagi tanaman berfungsi untuk menyuburkan tanaman, sebab unsur N dapat membentuk protein, lemak dan berbagai persenyawaan organik yang lain. Unsur Kalium (K) dapat memperkuat untuk tubuh tanaman, karena unsur ini dapat digunakan untuk memperkuat serabut-serabut akar, sehingga daun, bunga dan buah tidak mudah gugur. Selain itu pada media MS diberikan unsur-unsur penting bagi pertumbuhan tanaman yaitu garam-garam organik seperti unsur hara makro, unsur hara mikro, vitamin, asam amino, karbohidrat, zat pengatur tumbuh yang telah dijelaskan dibagian kandungan penting dalam media kultur jaringan.

Unsur-unsur tersebut memiliki arti penting untuk kelangsungan pertumbuhan tanaman yang dikembangkan dengan kultur jaringan. Setiap unsur memiliki fungsi masing-masing, sehingga jika ada salah satu unsur yang tidak dipenuhi pasti pertumbuhan eksplan akan terganggu. Unsur-unsur dalam media kultur jaringan harus mendukung pertumbuhan eksplan, karena eksplan tidak dapat mencari unsur tersebut seperti saat berada ditanah. Oleh karena itu agar tingkat keberhasilan tinggi pada pengembangbiakan tanaman secara kultur jaringan unsur-usur pada media kultur jaringan harus lengkap sesuai dengan kebutuhan pertumbuhan eksplan tanaman agar menjadi individu baru.

Kultur Jaringan merupakan teknik memperbanyak tanaman dengan memperbanyak jaringan mikro tanaman yang ditumbuhkan secara invitro menjadi tanaman yang sempurna dalam jumlah yang tidak terbatas. Dasar teori dari teknik kultur jaringan ini adalah teori totipotensi sel yang menyatakan bahwa setiap sel organ tanaman akan mampu tumbuh menjadi tanaman yang sempurna jika ditempatkan di lingkungan yang sesuai. Teori totipotensi ini dikemukakan oleh G. Heberlandt tahun 1898. Dia adalah seorang ahli fisiologi yang berasal dari Jerman. Pada tahun 1969, F.C.Steward menguji ulang teori tersebut dengan menggunakan objek sel wortel. Dengan mengambil satu sel empulur wartel, F.C. Steward bisa menumbuhkannya menjadi satu individu wortel. Maka teori ini mempercayai bahwa setiap bagian tanaman dapat berkebang biak.karena seluruh bagian tanaman terdiri atas jaringan – jaringan hidup. Totipotensi dalam biologi sel menunjukkan kemampuan suatu sel untuk dapat memperbanyak diri dalam keseluruhan (total) kemungkinan perkembangan yang dimungkinkan. Kata sifat totipoten lebih banyak dipakai. Sel puncak, termasuk zigot, memiliki kemampuan ini. Pada tumbuhan, sel meristem yang berada pada titik tumbuh juga memiliki kemampuan ini.

Mekanisme dari totipotensi sel tanaman adalah sebagai berikut , totipotent sel dibentuk selama fase seksual dan reproduksi asexual termasuk spora dan zygot. Zygot adalah produk dari perpaduan dari dua gamet. Dalam beberapa organisme, sel berdiffereniasi dan dapat kembali melakukan totipotensi. Sebagai contoh, perkembangan manusia dimulai ketika sebuah sperma fertilizes menciptakan sebuah telur dan satu sel totipotent (zygote). Pada hari pertama setelah pembuahan, sel ini membagi menjadi identik totipotent sel. Kira-kira empat hari setelah pembuahan dan setelah beberapa siklus dari divisi sel, sel-sel ini mulai totipotent berspesialisasi. Pada tumbuhan, sel meristem yang berada pada titik tumbuh juga memiliki kemampuan ini.

Semua sel tanaman memiliki potensi untuk totipotensi. Mereka dapat menjadi spesialis pluripotent sel yang dapat menimbulkan banyak sel anak, namun tidak semua, dari sel-sel yang diperlukan untuk pengembangan organisme. Pluripotent sel mengalami lebih spesialisasi ke multipotent sel yang berkembang untuk menjadi sel-sel yang memiliki fungsi tertentu. Kemampuan totipotensi dapat diubah dengan mengganti lingkungan hidup/tumbuh sel. Modifikasi osmotik, nutrisi, hormon, atau sumber energi yang dipaparkan pada sel dapat mengubah sifat ini menjadi pluripoten (“banyak potensi”), multipoten (“berbagai potensi”), atau unipoten (“tunggal potensi”). Sel yang pluripoten memiliki kemampuan berubah yang masih banyak, multipoten hanya beberapa, dan unipoten adalah bentuk sel yang telah terspesifikasi.

Pada praktikum ini eksplant yang digunakan adalah embrio jagung, umbi bawang merah dan sel tanaman anthurium. Berdasarkan hasil pengamatan hari ke-3, semua eksplant tidak ada yang terkontaminasi. Semua eksplant mulai membentuk sel-sel baru kecuali eksplant anthurium yang belum menunjukkan adanya perubahan. Eksplant jagung pada ulangan pertama telah tumbuh 2 akar dan 2 tunas, pada ulangan ke-2 hanya tumbuh 1 akar dengan 1 tunas. Pada eksplant umbi bawang merah ulangan pertama dan ulangan ke-2 eksplant hanya terlihat tumbuh 1 akar dengan 1 tunas. Sedangkan eksplant anthurium baik ulangan pertama dan ke-2 belum terlihat adanya organ baru tanaman yang terbentuk.

Setelah dilakukan pengamatan sampai hari ke-7 setelah eksplant ditanamam terdapat berbagai perubahan, diantaranya telah muncul berbagai organ tanaman yang baru. Pada eksplant jagung ulangan pertama telah terlihat tanaman muda jagung dengan batang dan daun yang berwarna hijau, telah tumbuh 4 akar dan 1 tunas sehat, sedangkan pada ulangan ke-2 tumbuh 3 akar dan 3 tunas. Eksplant-eksplant jagung tersebut tidak ada yang terkontaminasi.

Pada eksplant bawang merah ulangan pertama eksplant terkontaminasi oleh jamur meskipun demikian eksplant ini telah tumbuh 11 akar dengan 3 tunas. Indikasi bahwa eksplant bawang merah terkontaminasi oleh jamur adalah adanya koloni jamur berwarna hitam yang menempel pada eksplant bawang merah.

Pada ulangan ke-2 bawang merah telah mampu menumbuhkan 13 akar dengan 6 tunas dan eksplant ini adalah eksplant yang menujukkan tingkat keberhasilan tertinggi. Sedangkan pada eksplant anthurium yang pada hari ke-3 belum tumbuh organ baru hingga hari ke-7 eksplant anthurium belum menunjukkan perubahan. Eksplan anthurium terkontaminasi oleh jamur baik ulangan pertama dan ulangan ke-2. Hal tersebut yang mengakibatkan eksplant anthurium tidak dapat berkembang hingga hari ke-7. Pada praktikum ini telah membuktikan bahwa kontaminan oleh jamur maupun bakteri dapat mengganggu pertumbuhan eksplan seperti yang terjadi oleh eksplant anthurium dan bawang merah. Berikut adalah gambar dari eksplan yang tidak terkontaminasi dan eksplan yang terkontaminasi.

Gambar 1. Eksplan jagung yang tidak terkontaminasi (kiri) dan eksplan bawang merah yang terkontaminasi (kanan).

Pada praktikum ini selain mengandalkan teori totipotensi agar cepat terbentuk tanaman baru maka diperlukan penambahan hormon pada eksplan. Hormon adalah bahan organik yang disintesa pada jaringan tanaman. Hormon diperlukan dalam konsentrasi yang rendah untuk mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Banyak molekul sintetis organik yang telah dikenal memiliki aktivitas serupa hormon. Senyawa sintetis dan hormon yang secara alami ada, dikenal dengan sebutan zat pengatur tumbuh (ZPT).

Kultur jaringan merupakan manipulasi pertumbuhan tanaman dalam kondisi yang terkontrol dengan baik dan auksin serta sitokinin berperan penting dalam manipulasi ini. Kebanyakan eksplan memerlukan hormon auksin dan sitokinin. Dalam kultur jaringan, tambahan (exogenous) zat pengatur tumbuh diberikan untuk memperoleh efek pertumbuhan. Sebagai panduan umum, auksin atau sitokinin atau keduanya ditambahkan ke dalam kultur untuk memperoleh respon pertumbuhan. Pada praktikum ini penambahan hormon yang digunakan adalah hormon auksin IBA dan sitokinin BAP.

Indole-3-asam butirat (IBA) adalah hormon tanaman jenis auksin dan merupakan bahan dalam memperbanyak produk tanaman hortikultura komersial khususnya pada sistem perakaran. IBA tidak larut dalam air, biasanya dilarutkan dalam 75% atau alkohol murni. IBA juga tersedia sebagai garam yang larut dalam air. Larutan harus disimpan di tempat yang sejuk dan gelap untuk hasil terbaik.

Hormon yang bersifat memacu pertumbuhan dan perkembangan, beberapa hormon yang memacu pertumbuhan diantaranya auksin, sitokinin, dan giberelin. Pada praktikum ini hormon yang digunakan adalah IBA dan BAP dengan berbagai konsentrasi.

1. Hormon Auksin

Hormon ini ditemukan di bagian pucuk tumbuhan yang sedang tumbuh. Hormon ini disintesis di meristem apikal ujung batang kemudian disebarkan ke seluruh bagian tubuh tumbuhan dengan gerakan terpolarisasi ke satu arah. Di alam dijumpai beberapa macam auksin, yaitu IAA, 4-kloro IAA (terdapat pada biji kacang- kacangan muda), asam fenil asetat (PAA), dan asam indol butirat (IBA). Sementara auksin yang disintesis adalah NAA, 2, 4D, dan MCPA (asam 2-metil-4- klorofenoksiasetat). Auksin mempengaruhi pemanjangan sel yang kemudian diikuti oleh tekanan turgor di dalam sel untuk memperkuat dinding sel. Auksin berfungsi sebagai:

1. Mempengaruhi pembentukan akar lateral dan adventif

2. Memacu berbagai jenis sel tumbuhan untuk menghasilkan etilen

3. Mempengaruhi pertumbuhan kuncup samping

4. Menyebabkan batang tumbuhan membengkok karena distribusi auksin yang tidak merata pada batang sehingga menyebabkan pemanjangan sel yang tidak sama

5. Menginduksi pembelahan kambium vaskuler, dan

6. Memacu perkembangan bunga dan buah

Pada tahap reproduksi, IAA terdapat di dalam polen, buah, biji, atau organ- organ lain. Auksin sintesis 2,4 D merupakan herbisida untuk memberantas gulma. Dalam konsentrasi rendah 2,4 D berfungsi sebagai zat pengatur tumbuh, tetapi dalam konsentrasi tinggi sebagai racun. IAA bertanggung jawab terhadap dominasi apikal, yaitu pola pertumbuhan dimana ujung pucuk batang mencegah tumbuhnya tunas aksiler.

2. Hormon Sitokinin

Sitokinin merupakan senyawa yang berasal dari suatu senyawa yang mengandung nitrogen, yaitu adenin. Hormon ini ditemukan oleh Overbeek di dalam air kelapa. Dalam penelitiannya, hormon ini berperan dalam memacu pembelahan sel (sitokinesis). Hormon ini terdapat pada organ yang muda, disintesis di akar, dan diangkut ke atas melalui xilem. Sitokinin berfungsi dalam:

1. Memacu perkembangan kloroplas dan sintesis klorofil

2. Membantu pembesaran sel- sel kotiledon dan daun dikotil

3. Memacu perkembangan kuncup samping, dan

4. Memacu pembelahan sel dan pembentukan tunas pucuk

Pada praktikum terdapat beberapa hal yang dapat mengakibatkan kegagalan dalam teknik kultur jaringan. Pada beberapa kasus kegagalan kultur jaringan yang paling umum adalah terkontaminasi oleh patogen, inokulum yang tumbuh abnormal, dan eksplan tidak berkembang sama sekali. Teknik sterilisasi dan pemenuhan kandungan dalam media merupakan hal terpenting yang menentukan keberhasilan teknik ini. Jika alat, media, bahan tanam atau lingkungan kerja tidak steril maka eksplan dapat terkontaminasi oleh jamur atau bakteri. Bahkan kemungkinan eksplan tidak dapat tumbuh menjadi tanaman baru karena unsur penting dalam media kultur yang jumlahnya terbatas telah terkontaminasi atau telah digunakan untuk tumbuhnya jamur. Selain kontaminasi yang disebabkan oleh kurang sterilnya peralatan kultur jaringan, terdapat faktor kegagalan lain dalam teknik ini yaitu kurangnya kandungan unsur dalam media kultur jaringan.

Unsur-unsur dalam media kultur jaringan harus mendukung pertumbuhan eksplan, karena eksplan tidak dapat mencari unsur tersebut seperti saat berada ditanah. Oleh karena itu agar tingkat keberhasilan tinggi pada pengembangbiakan tanaman secara kultur jaringan unsur-usur pada media kultur jaringan harus lengkap sesuai dengan kebutuhan pertumbuhan eksplan tanaman agar menjadi individu baru.

BAB 5. PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan praktikum tersebut dapat diperoleh beberapa kesimpulan, diantaranya :

1. Sterilisasi sangat berperan dalam keberhasilan teknik kultur jaringan.

2. Teknik Aseptik bertujuan untuk mensterilkan semua peralatan, bahan tanam dan lingkungan kerja kultur jaringan.

3. Terdapat berbagai macam media kultur jaringan beserta eksplan yang sesuai dengan media tersebut, tetapi pada umumnya semua jenis media harus mengandung unsur-unsur yang dibutuhkan eksplan untuk membentuk tanaman baru.

4. Kontaminasi yang banyak terjadi pada beberapa kasus kegagalan kultur jaringan disebabkan oleh jamur dan bakteri.

5.2 Saran

Praktikan harus lebih mengutamakan sterilitas dari alat, bahan tanam (eksplant) dan lingkungan kerja agar tingkat keberhasilan kultur jaringan lebih tinggi.

DAFTAR PUSTAKA

Avivi, S dan Ikrarwati. 2004. Mikropropagasi Pisang Abaca (Musa textillis nee) Melalui Teknik Kultur Jaringan . Jurnal Ilmu Pertanian. Vol. 11(2): 27-34.

Djapfar, Z.R. 1990. Dasar-Dasar Agronomi. Palembang : WUAE Project.

Desriatin, N.L. 2004. Pengaruh Kombinasi Zat Pengatur Tumbuh Iaa Dan Kinetin Terhadap Morfogenesis Pada Kultur In Vitro Tanaman Tembakau (Nicotiana tabacum L. var. Prancak-95). Jurnal Jaringan Tembakau. Vol. 11 (7):15-22.

Iswanto, H. 2002. Petunjuk Perawatan Anggrek. Jakarta: AgroMedia Pustaka.

Nurwahyuni, Isnaini dan Elimasni. 2006. Pertumbuhan Dan Perkembangan Kultur Jaringan Kemenyan Sumatrana (Styrax Benzoin Dryander). Jurnal Biologi Sumatera. Vol. 1(2):26-33.

Oktafiani, Aastri, dkk. 2001. Pengaruh Beberapa Media Kultur Jaringan Terhadap Pertumbuhan Planlet Anggrek Phalaenopsis bellina. Jurnal Akta Agrosia. Vol. 4(6):25-31

Prahandini PE, Sudaryono RT & Purnomo S. 1993.Komposisi Media dan Eksplan Kutur Jaringan. Jakarta : Rajawali press

Priadi, Doy, dkk.2008. Pertumbuhan In vitro Tunas Ubi Kayu (Manihot esculenta Crantz) pada Berbagai Bahan Pemadat Alternatif Pengganti Agar. Jurnal BIODIVERSITAS. Vol. 9(1):9-12.

Salisbury, F.B & Ross, C.W. 1995. Fisiologi Tumbuhan. Bandung : ITB.

Santoso. 2003. Kultur Jaringan Tanaman. Malang : UMM Press.

Sitorus, E.N, dkk.2011. Induksi Kalus Binahong (Basella rubra L.) Secara In Vitro Pada Media Murashige & Skoog Dengan Konsentrasi Sukrosa Yang Berbeda. Jurnal BIOMA. Vol.13 (1):7-12.

Suryowinoto, M. 1996. Pemuliaan Tanaman secara In Vitro. Yogtakarta : Kanisius.

Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman. Jakarta : Bumi Aksara.

George. 1993. Plant Propagation by Tissue Culture Part 1 The Technology. England : Exegetics Press.

LAMPIRAN FOTO MEDIA DAN EKSPLAN KULTUR JARINGAN KELOMPOK 3